Métodos de laboratorio...................

MÉTODOS DE LABORAT ORIO
PARA ENSAYOS DE SENSI BILIDAD DE BACT ERIAS FRENTE A ANTIMICROBI ANOS




INTRODUCCION

La amplia propagación de bacterias patógenas con resistencia múltiple a los antibióticos ha sido reconocida como un importante problema global para la sanidad animal y humana por la OIE y la Organización Mundial de la Salud. La aparición de resistencias a antimicrobianos en diversas bacterias patógenas ha convertido a las pruebas de sensibilidad frente a estas sustancias en algo esencial cuando se emplean antimicrobianos con fines terapeúticos. La resistencia de un patógeno frente a un antimicrobiano determinado permite predecir que el tratamiento no resultará eficaz, mientras que la sensibilidad del patógeno al mismo constituye una excelente base para elegir el tratamiento antibacteriano adecuado. Por tanto, el ensayo de sensibilidad frente a antimicrobianos es un importante componente de cualquier programa eficaz de tratamiento. Además, en el caso de bacterias patógenas aisladas, las pruebas de sensibilidad inciden en las directrices generales que deben seguirse a nivel mundial para un uso prudente de los antimicrobianos en la producción animal, y los veterinarios deberían tener en cuenta estos datos (1).

Las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos son también la base del control epidemiológico de las bacterias patógenas para el hombre y los animales. Tal control suministra un punto de partida para elegir adecuadamente un tratamiento empírico (primera línea de terapia) y para detectar la aparición y/o la diseminación de cepas bacterianas resistentes así como los determinantes de la resistencia en diferentes especies de bacterias. La estandarización y homologación de las diversas metodologías de ensayo de sensibilidad frente a antimicrobianos, utilizadas en el control epidemiológico de la resistencia a compuestos antimicrobianos, constituyen un factor clave si se pretende comparar datos entre los diferentes programas nacionales e internacionales de seguimiento de los paises miembros de la OIE. Resulta esencial que los métodos de ensayo de sensibilidad a antimicrobianos generen resultados reproducibles en laboratorios de uso diario y que los datos puedan ser comparables con los resultados obtenidos por un método patrón de referencia conocido como la “norma de oro”. En ausencia de métodos estandarizados o de procedimientos de referencia, los resultados de sensibilidad obtenidos en laboratorios diferentes no pueden compararse con fiabilidad.


Este Capítulo contiene directrices metodológicas para las pruebas de sensibilidad frente a antimicrobianos e incluye procedimientos para estandarizar y normalizar la interpretación de los resultados de dichas pruebas.

1. Requerimientos de las pruebas

Para lograr la estandarización de los métodos de determinación de la sensibilidad a antimicrobianos y la comparación de sus resultados, hay que tener en cuenta los siguientes principios:

i) Son cuestiones esenciales el uso de métodos estandarizados y la homologación de los datos sobre sensibilidad (incluyendo los criterios de interpretación).

ii) Tanto los métodos estandarizados como unos criterios similares de interpretación deberían ser aceptados y usados por todos los laboratorios implicados.

iii) Todos los métodos de determinación de sensibilidad a antimicrobianos deberían dar lugar a resultados reproducibles.



iv) Todos los datos han de poder describirse en términos cuantitativos

v) Resulta esencial establecer una red de laboratorios designados a nivel nacional o regional para coordinar las metodologías, interpretaciones y controles de calidad de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos.

vi) Los laboratorios de Microbiología deberían llevar a cabo su trabajo dentro de un sistema interno de aseguramiento de la calidad.

vii) Los laboratorios deberían estar acreditados, siempre que sea posible, y participar en programas externos de mejora.

viii) La existencia de cepas bacterianas específicas para referencia y control de calidad resulta necesaria a fin de determinar el nivel de control de calidad, la seguridad y la mejora de las pruebas dentro de un mismo laboratorio, y entre varios laboratorios.

2. Metodología de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos

Deben tenerse en cuenta las siguientes exigencias:

i) Las bacterias sometidas a ensayo deben aislarse en cultivo puro a partir de las muestras enviadas.

ii) El procedimiento para el aislamiento de cada bacteria en particular debe estar estandarizado, de modo que las bacterias analizadas puedan ser identificadas de forma correcta y lógica hasta el nivel de género y/o especie.

iii) Cuando sea posible, las bacterias aisladas deben ser guardadas para ulteriores análisis (mediante liofilización o conservación en frío entre -70 y -80ºC).

A su vez, se requiere la estandarización de los siguientes factores que influencian los ensayos de sensibilidad frente a antimicrobianos:

i) Una vez que se ha aislado la bacteria en cultivo puro, el inóculo debe normalizarse para obtener resultados precisos de sensibilidad.

ii) La composición de los medios sólidos y líquidos utilizados (en cuanto a pH, catione timidina o timina, o el uso de medios de cultivo suplementados).

iii) El contenido de la sustancia antimicrobiana en la forma utilizada de suministro (en disco, tira o tableta).

iv) La composición de los solventes y diluyentes empleados en la preparación de las soluciones stock de antimicrobianos.

v) Las condiciones de crecimiento e incubación (tiempo, temperatura, tipo de atmósfera, por ejemplo presencia de CO2).

vi) Concentración del agar como agente solidificante. vii) Los criterios posteriores de interpretación.

Por estos motivos, se debe destacar la especial importancia de los procedimientos normalizados y de los métodos estandarizados, ya que sólo puede lograrse una reproducibilidad adecuada mediante el uso de una metodología modelada.

3. Selección de la metodología para determinar la sensibilidad al antimicrobiano

La selección de una metodología apropiada para determinar la sensibilidad frente a los antimicrobianos debe estar basada en los siguientes principios:

i) Facilidad de realización ii) Flexibilidad
iii) Adaptación a sistemas automatizados o semiautomatizados iv) Coste
v) Reproducibilidad vi) Fiabilidad
vii) Exactitud

viii) Preferencias nacionales e internacionales.



4. Métodos de ensayo

Los tres métodos que se citan a continuación son los únicos que suministran resultados significativamente reproducibles:

i) Difusión en disco

ii) Dilución en medio líquido

iii) Dilución en medio sólido con agar

a) Método de difusión en disco

La difusión en disco hace referencia a la difusión que experimenta un agente antimicrobiano a una determinada concentración a partir de discos, tiras o tabletas, que se depositan en un medio de cultivo sólido que ha sido sembrado con un inóculo bacteriano estandarizado. El método de difusión en disco se basa en la determinación de una zona de inhibición del crecimiento que es proporcional a la sensibilidad de la bacteria frente al antimicrobiano presente en el disco.

La difusión de un antimicrobiano en un medio de cultivo inoculado crea un gradiente de la sustancia antimicrobiana. Cuando su concentración llega a ser tan diluida que no logra inhibir el crecimiento de la bacteria ensayada, termina la zona de inhibición. Teóricamente, el borde de esta zona de inhibición se corresponde con la concentración mínima inhibitoria (MIC) para esa combinación concreta de bacteria y antimicrobiano. En otras palabras, la zona de inhibición se correlaciona de modo inversamente proporcional con el valor de la MIC para la bacteria ensayada. En general, cuanto mayor es la zona de inhibición, menor es la concentración de antimicrobiano que se requiere para inhibir el crecimiento de los microorganismos. No obstante, esto depende también de la concentración del antibiótico en el disco y de su capacidad de difusión.

Hay que advertir que las pruebas de difusión en disco basadas solamente en la presencia o ausencia de una zona de inhibición, sin considerar su tamaño, no son aceptables como ensayos para la sensibilidad a antimicrobianos desde el punto de vista metodológico.

• Consideraciones sobre el uso de la técnica de difusión en disco

La difusión en disco es fácil de realizar, reproducible, y no requiere disponer de una infraestructura cara. Sus principales ventajas son:

i)Bajo coste

ii) Facilidad para modificar los discos con los antimicrobianos de prueba cuando ello se requiere.

La medición manual de las zonas de inhibición puede llevar excesivo tiempo. Sin embargo, existen dispositivos automáticos que permiten leer las zonas y que pueden integrarse en sistemas de procesamiento de datos y de informes de laboratorio. Se puede colocar hasta un máximo de 12 discos por cada placa de cultivo de 150 mm de diámetro y un máximo de 5 discos por placa de 100 mm. Independientemente del número de discos depositados sobre la superficie del medio solidificado con agar, éstos deben de estar distribuidos de forma uniforme de modo que no estén a una distancia menor de
24 mm, desde el centro de un disco al centro de otro.

b) Métodos de dilución en medio líquido y en medio sólido

La finalidad de estos métodos es determinar la concentración más baja del antimicrobiano ensayado que es capaz de inhibir el crecimiento de la bacteria analizada (MIC, concentración mínima inhibitoria, que normalmente se expresa en microgramos/mililitro o miligramos/litro). Sin embargo, la MIC no siempre representa un valor absoluto. La "verdadera" MIC es un punto que se encuentra entre la concentración más baja del ensayo que inhibe el crecimiento de la bacteria y la siguiente concentración más baja del ensayo.

El rango de los antimicrobianos debería:

i) Abarcar tanto los criterios de interpretación (sensibilidad, valor intermedio y resistencia) como los organismos de referencia para el control de calidad.

ii) Tener en consideración las concentraciones de antimicrobiano que se pueden alcanzar in vivo para una combinación específica de antibiótico y bacteria.



Los métodos para determinar la sensibilidad a antimicrobianos que se basan en diluciones parecen ser mas reproducibles y fáciles de cuantificar que los basados en difusión. Sin embargo, los antibióticos se ensayan normalmente mediante diluciones en serie reduciendo la concentración a la mitad, lo que puede originar datos inexactos en cuanto a la MIC.

Cualquier laboratorio que pretenda usar un método de dilución y utilizar sus propios reactivos y diluciones de antibióticos debería tener la capacidad de obtener, preparar y mantener un stock de soluciones de antimicrobianos de pureza adecuada y generar diluciones de trabajo de modo regular. Por consiguiente, es importante que tales laboratorios usen organismos de control garantizado (ver más adelante) para asegurar la precisión y estandarización en sus procedimientos.

•Dilución en caldos de cultivo.

La dilución en medio líquido es una técnica en la que se prueba una suspensión normalizada de bacterias frente a varias concentraciones de un agente antimicrobiano (normalmente mediante diluciones seriadas que reducen la concentración a la mitad) en un medio líquido estandarizado. El método se puede realizar tanto en tubos con un contenido mínimo de 2 ml (macrodilución) como en volúmenes más pequeños, utilizando placas de microtitulación (microdilución). Existen comercialmente en el mercado varios tipos de placas de microtitulación que contienen antibióticos prediluidos dentro de los pocillos de las placas. El uso de lotes idénticos de estas placas de microtitulación ayuda a eliminar errores potenciales que pueden surgir durante la preparación y dilución de los antimicrobianos. Dicho uso, junto a un protocolo normalizado, incluyendo cepas de referencia con control de calidad, puede facilitar la homologación si se dispone de suficientes recursos financieros.

Debido a que en la actualidad la mayor parte de las pruebas para antimicrobianos mediante microdilución en medio líquido se preparan comercialmente, estas pruebas pueden considerarse menos flexibles que las basadas en dilución en medio sólido o en difusión en disco en cuanto a su capacidad para admitir cambios necesarios derivados del programa de control y seguimiento.

Como la compra de la infraestuctura necesaria y el conjunto de antimicrobianos puede resultar costosa, esta metodología no se suele elegir en laboratorios con presupuestos limitados.

• Dilución en medio sólido

La dilución en medio sólido implica la incorporación de un agente antimicrobiano a concentraciones progresivamente crecientes en un medio solidificado con agar y la aplicación de un inóculo bacteriano definido a la superficie de la placa que contiene el agar. A menudo, los resultados derivados de estos ensayos se consideran como los estándares de oro en la determinación del valor MIC para una determinada combinación bacteria/antimicrobiano en una prueba concreta.

Las ventajas de los métodos de dilución en medio sólido son:

i) Un mayor control en la pureza de la bacteria ensayada.

ii) La capacidad de ensayar simultáneamente varias bacterias en una misma placa de medio con agar.

iii) La mejora potencial en cuanto a la determinación de valores MIC por extensión del rango de concentraciones del antimicrobiano.

iv) Posibilidad de semi-automatizar el procedimiento mediante la utilización de un replicador del inóculo.
Existen en el mercado unos replicadores de los inóculos que pueden transferir entre 32 y 36 inóculos bacterianos diferentes a cada una de las placas con medio sólido.

Los métodos de dilución en medio sólido tienen algunos inconvenientes, por ejemplo:

i) Son muy laboriosos y requieren importantes recursos económicos y técnicos. ii) Una vez que se preparan deben usarse en el término de una semana.
iii) Los puntos finales no son siempre fáciles de determinar ni resulta fácil verificar la pureza del inóculo.

La dilución en medio sólido se recomienda a menudo como un ensayo estandarizado para medir la sensibilidad a antimicrobianos de organismos difíciles de cultivar, como es el caso de especies de Helicobacter y Campylobacter. Sin embargo, al menos en la práctica veterinaria, la microdilución en medio líquido también funciona muy bien con organismos como Haemophilus, Campylobacter y Brachyspira, entre otros.



c) Otras pruebas para determinar la sensibilidad a bacterias y la resistencia a antimicrobianos específicos

Las concentraciones mínimas inhibitorias de antimicrobianos para bacterias se pueden obtener, además, mediante tiras de gradientes disponibles en el mercado que permiten la difusión de una concentración preformada de antibiótico. Sin embargo, el uso de tiras de gradientes puede ser muy caro y originar discrepancias en cuanto a MIC cuando sus resultados se comparan con los obtenidos mediante dilución en medio sólido (2).

Cualquiera que sea el método usado, los procedimientos deberían estandarizarse para lograr resultados exactos y reproducibles. Cada vez que se realiza una prueba de sensibilidad a antimicrobianos se necesita probar también los microorganismos de referencia con control de calidad para asegurarse de la exactitud de los datos.

La elección apropiada en cuanto al sistema para determinar la sensibilidad dependerá, en último término de las propiedades de crecimiento de la bacteria en cuestión. En circunstancias especiales, pueden resultar adecuados nuevos métodos para la detección de fenotipos de resistencia particulares. Por ejemplo, pruebas basadas en cefalosporinas cromogénicas (como nitrocefin) o pruebas equivalentes, pueden revelar resultados rápidos y fiables sobre determinación de beta-lactamasas en algunas bacterias.

De modo similar, puede detectarse un amplio espectro de actividad beta-lactamasa en algunas bacterias mediante métodos estándar de sensibilidad por difusión en disco utilizando cefalosporinas específicas (cefotaxima y ceftazidima) en combinación con un inhibidor de beta-lactamasas (como el ácido clavulánico), y midiendo las zonas de inhibición resultantes. Además, la resistencia al cloranfenicol atribuible a la producción de cloranfenicol-acetil transferasa se puede detectar en algunas bacterias mediante pruebas rápidas en un tubo o en papel de filtro en cuestión de 1-2 horas (4).

5. Puntos críticos de sensibilidad y criterios de zona de inhibición

El objetivo de una prueba de sensibilidad in vitro a los antimicrobianos es predecir el modo en que un patógenos bacteriano va a responder al agente antimicrobiano in vivo. Independientemente de si se usan métodos de difusión o de dilución, los resultados de estas pruebas in vitro clasifican las bacterias respecto a la acción de un antimicrobiano particular como resistentes, sensibles o con efecto intermedio.

Los puntos críticos de sensibilidad a antimicrobianos los establecen organizaciones nacionales, sociedades profesionales o agencias reguladoras. Deberían consultarse los documentos pertinentes. No obstante, pueden existir notables diferencias entre diferentes países en relación con un mismo agente antimicrobiano.

Como se ha indicado previamente, los resultados de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos deberían expresarse cuantitativamente:

i) como distribución de concentraciones mínimas inhibitorias en miligramos por litro. ii) como diámetros de zonas de inhibición en milímetros.

Los dos siguientes factores son importantes para interpretar si una bacteria es sensible o resistente a un agente antimicrobiano:

i) El desarrollo y establecimiento de intervalos de control de calidad, usando siempre que sea posible pruebas de difusión y pruebas de dilución para microorganismos de control de calidad.

Esto resulta esencial para validar el método específico de sensibilidad a antimicrobianos que se use. Las series de control de calidad para los microorganismos control deberían establecerse antes de determinar los puntos críticos de sensibilidad o resistencia.

ii) La determinación de criterios de interpretación apropiados.

Esto implica la generación de tres distintos tipos de datos:

• distribución poblacional de valores MIC para organismos relevantes

• parámetros farmacocinéticos del agente antimicrobiano

• resultados de ensayos clínicos y experiencia

La interpretación de los datos incluye la creación de un diagrama de puntos a partir de la distribución de la población bacteriana (aislamientos bacterianos representativos), representando la zona de inhibición frente al



valor MIC para cada bacteria patógena. La selección de puntos críticos se basará en múltiples factores, incluyendo el análisis de la línea de regresión que correlaciones los valores MIC y los diámetros zonales de inhibición, distribución de poblaciones bacterianas, límites de error, farmacocinética y, finalmente, la verificación clínica.

El desarrollo del concepto de "puntos críticos microbiológicos", que se basa en las distribuciones poblacionales de la especie bacteriana concreta comprobada, puede ser mas adecuado para algunos programas de control. En este caso los aislamientos de bacterias que se desvían de la población sensible normal se deberían considerar resistentes, y los cambios de sensibilidad en una combinacion específica antimicrobiano/bacteria podrían ser objeto de seguimiento (5).

6. Directrices para las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos

Se dispone actualmente de varias directrices a nivel mundial para las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos y para los correspondientes criterios de interpretación de las pruebas. Entre otras, se incluyen las directrices y referencias publicadas por:

Comité Nacional para Estándares de Laboratorios Clínicos (NCCLS) Sociedad Británica de Quimioterapia Antimicrobiana (BSAC)
Comité de Antibiogramas de la Sociedad Francesa de Microbiología (CASFM) Instituto Alemán de Normativas (DIN)
Sociedad Japonesa de Quimioterapia (JSC)
Werkgroep richtlijnen gevoeligheidsbepalingen (Sistema WRG, Países Bajos)

Hasta ahora, solo el NCCLS ha desarrollado protocolos para ensayos de sensibilidad de bacterias aisladas de animales y ha determinado criterios interpretativos (4). Sin embargo, existen protocolos y directrices disponibles de varias organizaciones y sociedades profesionales sobre pruebas de sensibilidad para especies bacterianas afines que causan infecciones en humanos. Es posible que se puedan adoptar tales directrices para las pruebas de sensibilidad de bacterias aisladas de animales pero cada país debe evaluar sus propias directrices y pautas de estandarización. Además, están progresando determinados esfuerzos encaminados a homologar a escala internacional los puntos críticos de sensibilidad. Estos esfuerzos inciden principalmente en la adopción de los estándares y directrices del NCCLS, que contempla la existencia de laboratorios con métodos normalizados y valores de control de calidad que permiten establecer comparaciones sobre las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos y sobre los datos generados. Para los países miembros de la OIE que no tienen métodos de determinación de sensibilidad estandarizados, la adopción de las indicaciones y los estándares del NCCLS debería ser un paso inicial apropiado.

Como primer paso hacia una comparación de datos de seguimiento y control, se anima a los países miembros a diseñar un programa homologado y estandarizado (6). Los datos procedentes de países que usan otros diseños metodológicos y de estudio pueden no ser directamente comparables (3,6). A pesar de esto, los datos acumulados a lo largo del tiempo en un determinado país pueden servir al menos para permitir la detección de apariciones de resistencia microbiana o tendencias en la prevalencia de resistencias en dicho país. No obstante, si se presentan juntos los resultados que se han obtenido con diferentes métodos, debe demostrarse que es posible la comparación de los resultados y que se puede alcanzar un consenso interpretativo.

Nótese que esto podrá llevarse a cabo más fácilmente utilizando métodos de determinación de la sensibilidad a antimicrobianos que sean exactos y fiables, acoplados a un seguimiento operativo de los ensayos, y con el empleo por los laboratorios participantes de cepas bacterianas con control de calidad definido.

7. Comparación de resultados

Para determinar la comparación de resultados que se originan en diferentes sistemas de vigilancia, los resultados deben ser cuantitativos y deben incluir información sobre los métodos, organismos de control de calidad e intervalos de concentración de antimicrobianos empleados, así como los criterios de interpretación usados.

8. Control de calidad y seguridad de calidad

Los laboratorios que realizan determinaciones de sensibilidad a antimicrobianos deberían establecer sistemas adecuados para lograr tanto control de calidad como seguridad de calidad.

Deben verificarse los siguientes componentes:

i) precisión del procedimiento de ensayo ii) exactitud del procedimiento de ensayo



iii) personal del laboratorio.

iv) funcionamiento de los reactivos apropiados

También deberían respetarse las siguientes exigencias:

i) Estricto cumplimiento de las técnicas estandarizadas junto a un control de calidad de los medios y reactivos. ii) Mantener registro de:
• los números de lote de todos los materiales y reactivos adecuados

• las fechas de caducidad de todos los materiales y reactivos

iii) También debería comprobarse que las bacterias de referencia tienen el adecuado control de calidad vi)
para asegurar la estandarización, independientemente del método utilizado para determinación de sensibilidad.

iv) Las cepas bacterianas de referencia tendrían que ser catalogadas y caracterizadas por fenotipos estables y definidos en cuanto a sensibilidad a los antimicrobianos.

v) Los laboratorios implicados en los ensayos deberían utilizar las cepas de referencia apropiadas con control de calidad.

vi) Las cepas de referencia deben mantenerse en cultivos stock de los que se puedan derivar subcultivos de trabajo y deben proceder de colecciones de cultivo nacionales o internacionales. Las cepas bacterianas de referencia deben mantenerse en laboratorios centrales o regionales designados al efecto.

vii) El mejor método para analizar en su conjunto las realizaciones de cada laboratorio es ensayar las cepas bacterianas con control de calidad cada día que se lleven a cabo pruebas de sensibilidad.

Como esto no siempre resulta fácil o económico, la frecuencia de tales ensayos de control de calidad puede reducirse si el laboratorio demuestra que los procedimientos seguidos para determinar la sensibilidad son reproducibles. Si aparecen errores con los controles de calidad, el laboratorio tiene la responsabilidad de determinar las causas y repetir las pruebas. En caso de que no pueda determinar el origen de los errores, los ensayos de control de calidad deberían reiniciarse diariamente.

viii) Cada vez que se inicie el empleo de un nuevo lote de medio de cultivo o de placas, y de forma periódica, se debería probar el comportamiento de las cepas de control de calidad en paralelo con las cepas bacterianas a estudiar.

ix) Se debe tener en cuenta la adopción de medidas adecuadas de bioseguridad cuando se reciban o se envíen las cepas de referencia de control de calidad entre los laboratorios participantes. El empleo de tales cepas permitirá la comparación de los datos sobre la sensibilidad a antimicrobianos (fase de seguimiento).

9. Pruebas externas de capacitación

Para asegurar que los datos de sensibilidad que se describen son de hecho correctos, los países miembros de la OIE deberían llevar a cabo pruebas de capacitación externas (es decir, desarrolladas por una tercera parte). Estas pruebas de habilitación pueden desarrollarse a nivel nacional. Se invita a que los laboratorios de países miembros participen en comparaciones internacionales entre diferentes laboratorios. A este respecto, deberían tenerse en cuenta todas las especies bacterianas importantes.

Cada país debería designar o establecer laboratorios nacionales responsables de:

i) verificar los programas de seguridad sobre la calidad de los laboratorios que participan en el control y seguimiento de las resistencias frente a los antimicrobianos

ii) suministrar a dichos laboratorios un lote de cepas de referencia.

iii) Crear una base de datos centralizada, disponible en Internet (p. ej. EARSS) que contenga los diferentes perfiles de resistencia para cada especie bacteriana.



REFERENCIAS

1. ANTHONY F., ACAR J., FRANKLIN A., GUPTA R., NICHOLLS T., TAMURA Y., THOMPSON S., THRELLFALL E.J., VOSE D., VAN VUUREN M. & WHITE D.G. (2001). Antimicrobial resistance: responsible and prudent use of antimicrobial agents in veterinary medicine. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 20, 829–839.

2. BROWN D.F. & BROWN L. (1991). Evaluation of the E-test, a novel method of quantifying antimicrobial activity.
J. Antimicrob. Chemother., 26, 185–190.

3. LEEGARD T.M., CAUGANT D.A., FROHOLM L.O. & HOIB, E.A. (2000). Apparent differences in antimicrobial susceptibility as a consequence of national guidelines. Clin. Microbiol. Inf. Dis., 6, 290–293.

4. NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS (NCCLS) (2002). Document M31-A2.
Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from
Animals, Approved Standard, Second Edition. document M31-A2. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite
1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, USA, 80 pp.

5. RINGERTZ S., OLSSON-LILJEQUIST B., KAHLMETER G. & KRONVALL G. (1997). Antimicrobial susceptibility testing in Sweden II. Species-related zone diameter breakpoints to avoid interpretive errors and guard against unrecognised evolution of resistance. Scand. J. Infect. Dis. (Suppl.), 105, 8–12.

6. THRELFALL E.J., FISHER I.S.T., WARD L., TSCHAPE H. & GERNER-SMIDT P. (1999). Harmonization of antibiotic susceptibility testing for Salmonella: Results of a study by 18 national reference laboratories within the European Union-funded Enter-Net group. Microb. Drug Resist., 5, 195–199.

7. WHITE D.G., ACAR J., ANTHONY F., FRANKLIN A., GUPTA R., NICHOLLS T., TAMURA Y., THOMPSON S., THRELFALL J.E., VOSE D., VAN VUUREN M., WEGENER H., & COSTARRICA L. (2001). Standardisation and harmonisation of laboratory methodologies for the detection and quantification of antimicrobial resistance. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 20, 849–858.

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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para Ensayos de sensibilidad a antimicrobianos (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)